Окрашивание позволяет обнаружить микробы в микроскопическом материале, определить их количество и быстро изучить морфологические особенности микроорганизмов. Соотношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать комплекс генцианвиолета с йодом, образующийся в процессе окрашивания. Для окраски образец необходимо наносить тонким слоем для получения точных результатов окрашивания. В толстых мазках, в которых клетки расположены скоплениями, окраска часто выпадает в осадок, и грамотрицательные организмы труднее обесцвечиваются. Напротив, грамположительные организмы в скоплениях обесцвечиваются гораздо быстрее, чем одиночно расположенные клетки. Бактерии в препарате должны находиться на максимально возможном расстоянии друг от друга. Все смеси перед окрашиванием необходимо готовить заранее и отмерять в необходимом количестве. В противном случае последствия окрашивания могут быть искаженными или совсем неправильными.

Все бактерии по окраске по Граму делятся на грамположительные – темно-фиолетовые и грамотрицательные – красные. Способность окрашиваться в тот или иной цвет зависит от строения их клеточной стенки и коррелирует со многими другими свойствами бактерий. У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют ароматические и серосодержащие аминокислоты и отмечается низкое содержание липидов, у грамотрицательных, наоборот, эти вещества содержатся в больших количествах (Tortora, Funke & Case , 2019). Кроме того, у грамположительных бактерий имеется магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, которая отсутствует у грамотрицательных бактерий. Образует прочный химический комплекс с белком генцианвиолета и йодом, который не разрушается при кратковременном действии алкоголя. Грамотрицательные клетки не образуют такого комплекса, поскольку легко обесцвечиваются алкоголем. Фуксин окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет, а положительные – темнеют. Окраска бактерий по Граму основана на различной способности микроорганизмов удерживать в клетке трифенилметановые красители – кристаллический фиолетовый или генцианвиолет. Сущность метода обусловлена ​​различием химического состава и строения клеточной стенки бактерий. Как уже говорилось, все бактерии по этому признаку делятся на две группы: грамположительные – окрашивающиеся по Граму, грамотрицательные – не окрашивающиеся по Граму.

Основная ошибка при окраске по Граму — чрезмерное или недостаточное окрашивание мазка спиртом. В первом случае грамположительные бактерии могут утратить первоначальную окраску генцианвиолетом и приобрести красную окраску (характерную для грамотрицательных бактерий) в результате последующего окрашивания мазка фуксином. Во втором случае грамотрицательные бактерии могут сохранять сине-фиолетовую окраску генцианвиолета.

В процессе окрашивания по Граму необходимо четко соблюдать определенные этапы. Для окрашивания следует приготовить следующие растворы: 1) спиртовой раствор кристаллического фиолетового; 2) раствор йода Люголя; 3) отбеливающий раствор; 4) Сафранин. Если учащиеся скрестят первичный и вторичный красители и возьмут сафранин в качестве основного красителя и кристаллический фиолетовый в качестве встречного красителя, то результат будет неверным (Tripathi & Sapra, 2021). Результат будет неверным из-за разной структуры грамположительных и грамотрицательных клеток. При окраске клеток кристаллическим фиолетовым, а затем раствором Люголя в ЦМ образуется комплекс пептидогликан + йод + генцианвиолет, который затем обесцвечивается спиртом. У грамотрицательных бактерий весь окрашивающий комплекс вымывается из клеточной стенки, и они становятся бесцветными. В грамположительных случаях комплекс остается связанным в толстом слое пептидогликана. В результате после первого окрашивания грамположительные клетки становятся фиолетовыми, а грамотрицательные — прозрачными. 2-й этап окраски по Граму – этап докраски сафранином. После второго этапа грамположительные остаются фиолетовыми, а грамотрицательные становятся розовыми.

В заключение следует, что если допустить смешивание красителей и окрасить сначала сафранином, а затем кристаллическим фиолетовым, то клетки не обесцветятся и не окрасятся так, как должны. Из-за этого невозможно будет определить грамположительные и грамотрицательные клетки; в этом случае смысл окрашивания пропадает. Поэтому всегда очень важно соблюдать последовательность окрашивания.

Рекомендации

Тортора, Г.Дж., Функе, БР, и Кейс, КЛ (2019). Микробиология: введение. (13-е изд.). Пирсон. с.77 – 98.

Трипати, Н. Сапра, А. (2021). Окраска по Граму. Издательство StatPearls, Остров Сокровищ (Флорида).